Zestaw do syntezy pierwszej nici CDNA R1011/R1012 Odczynniki PCR z odwrotną transkryptazą
Szczegóły Produktu:
Miejsce pochodzenia: | Chiny |
Nazwa handlowa: | GDSBio |
Orzecznictwo: | / |
Numer modelu: | R1011/R1012 |
Zapłata:
Minimalne zamówienie: | 1 pudełko |
---|---|
Szczegóły pakowania: | mała paczka lub dystrybucja hurtowa lub OEM |
Czas dostawy: | 8 dni roboczych |
Zasady płatności: | L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram |
Możliwość Supply: | 100 pudełek / pudełek dziennie |
Szczegóły informacji |
|||
Kot. NIE.: | R1011/R1012 | Stężenie: | R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns) |
---|---|---|---|
Wygląd: | bezbarwny | Grupa: | Odczynniki do PCR z odwrotną transkryptazą |
Działalność: | Przechodzić | Możliwość wzmocnienia: | / |
Drukowanie logo: | Z nadrukiem logo | Pakiet transportowy: | Uszczelka |
Zdolność produkcyjna: | 100 pudełek / pudełek dziennie | Warunki przechowywania: | Przechowywać w temperaturze -20°C |
High Light: | 20 rxns odczynników do PCR z odwrotną transkryptazą,100 odczynników do PCR z odwrotną transkryptazą rxns,20 rxns zestaw do syntezy pierwszej nici cdna |
opis produktu
Zestaw RT - PCR
Wyłącznie do użytku badawczego
Nr kat. R1011, 20 rxns
Nr kat. R1012, 100 rxns
Elementy zestawu
Część | R1011 (20 rxns) | R1012 (100 rxns) |
M-MLV (200U/μl) | 20 μl | 100 μl |
RNazyna (40 U/μl) | 12 μl | 60 μl |
oligo(dT)15(50μM) | 20 μl | 100 μl |
Losowy podkład heksamerowy (50 μM) | 20 μl | 100 μl |
5× Bufor pierwszej nici | 80 μl | 400 μl |
ddH wolne od RNaz2O | 1 ml | 1 ml × 5 |
dNTP (po 10 mM) | 50 μl | 250 μl |
Składowanie
Wszystkie elementy zestawu należy przechowywać w temperaturze -20°C.Przechowywać kontrolne RNA w temperaturze -70°C w celu dłuższego przechowywania.
Dopis
Zestaw RT-PCR jest zoptymalizowany do syntezy pierwszej nici cDNA z oczyszczonego poli(A)+ lub całkowitego RNA.Zestaw RT-PCR do RT-PCR zapewnia zwiększoną wydajność cDNA, wysoką czułość i transkrypty pełnej długości w wygodnym formacie.Otrzymujesz wszystkie składniki potrzebne do udanej syntezy pierwszej nici cDNA, oszczędzając czas i zapewniając sukces w każdym eksperymencie.Zestaw Reverse Transcriptase to wersja M-MLV RT, która została zaprojektowana w celu zmniejszenia aktywności RNazy H i zapewnienia zwiększonej stabilności termicznej.Enzym jest używany do syntezy cDNA w zakresie temperatur 42-55°C, zapewniając zwiększoną specyficzność, wyższą wydajność cDNA i produkt o większej długości niż inne odwrotne transkryptazy.
Aplikacje
Synteza pierwszej nici cDNA do RT-PCR
Konstrukcja bibliotek cDNA
Jednoetapowy RT-PCR
Przedłużenie podkładu
Iważne notatki
Unikanie zanieczyszczenia rybonukleazą
Czystość i integralność RNA jest niezbędna do syntezy pełnej długości cDNA.RNA może zostać zdegradowane przez RNazę A, która jest wysoce stabilnym zanieczyszczeniem występującym w każdym środowisku laboratoryjnym.Wszystkie elementy zestawu zostały rygorystycznie przetestowane, aby upewnić się, że są wolne od RNaz.Aby zapobiec zanieczyszczeniu zarówno środowiska laboratoryjnego, jak i odczynników, wszystkie przygotowane roztwory muszą być wolne od RNaz.Ogólne zalecenia dotyczące unikania kontaminacji RNazami:
- Wszystkie probówki i końcówki pipet, które mają być użyte w syntezie cDNA, należy poddać obróbce DEPC lub używać certyfikowanego sprzętu laboratoryjnego wolnego od nukleaz.
- Podczas pracy z RNA i wszystkimi odczynnikami należy nosić rękawiczki, ponieważ skóra jest częstym źródłem RNaz.Często zmieniaj rękawiczki.
- Należy używać odczynników wolnych od RNaz, w tym wody wysokiej jakości (np. wody oczyszczonej DEPC).
- Użyj inhibitora RNazy, takiego jak Dongsheng RNasin (#R2011), aby chronić RNA przed działaniem RNaz.
- Wszystkie elementy zestawu należy szczelnie zamknąć, gdy nie są używane.Trzymaj wszystkie probówki szczelnie zamknięte podczas reakcji odwrotnej transkrypcji.
Matrycowy RNA
Całkowity komórkowy RNA wyizolowany standardowymi metodami jest odpowiedni do użycia z zestawem.Oczyszczone RNA musi być wolne od soli, jonów metali, etanolu i fenolu, aby uniknąć hamowania reakcji syntezy cDNA.Zanieczyszczenia śladowe można usunąć przez wytrącenie RNA etanolem, a następnie dwukrotne przemycie osadu zimnym 75% etanolem.W zastosowaniach RT-PCR matryca RNA musi być wolna od zanieczyszczenia DNA.Przed syntezą cDNA RNA można potraktować DNazą I w celu usunięcia śladowych ilości DNA.DNaza I musi być uzyskana przez użytkownika.Zawsze przeprowadzaj reakcję kontrolną (RT-minus), która obejmuje wszystkie składniki RT-PCR z wyjątkiem enzymu odwrotnej transkryptazy.
Trawienie RNazą H
Czułość etapu PCR można zwiększyć (zwłaszcza w przypadku długich matryc) poprzez usunięcie matrycy RNA z hybrydowej cząsteczki cDNA:RNA przez trawienie RNazą H po syntezie pierwszej nici.Obecność RNazy H podczas syntezy pierwszej nici spowoduje degradację matrycowego mRNA, co spowoduje zmniejszenie syntezy pełnej długości cDNA i zmniejszoną wydajność pierwszej nici cDNA.
Podkłady
Syntezę pierwszej nici cDNA można zapoczątkować starterem oligo(dT)15, starterami losowymi lub starterami specyficznymi dla genu.
Oligo(dT)15 inicjuje syntezę cDNA z ogona poli(A) obecnego na 3'-końcu eukariotycznego mRNA.Losowe startery inicjują syntezę cDNA z całkowitej populacji RNA (rRNA i mRNA).Dlatego stosowanie losowych starterów do syntezy pierwszej nici powoduje większą złożoność generowanego cDNA w porównaniu ze starterem oligo(dT)15.W konsekwencji czułość i specyficzność kolejnych reakcji PCR może być zmniejszona.Istnieje jednak kilka zastosowań, w których korzystne jest użycie losowych starterów, takich jak synteza cDNA przy użyciu mRNA bez ogona poli(A) lub synteza cDNA przy użyciu próbek RNA wzbogaconych w poli(A).
Startery specyficzne dla genu są używane do syntezy określonego cDNA z puli całkowitego RNA lub mRNA i muszą być uzyskane przez użytkownika.
Pierwszy- Sprocedura syntezy cDNA trand
Reakcja pierwszej nici cDNA może być przeprowadzona jako pojedyncza reakcja lub jako seria równoległych reakcji z różnymi matrycami RNA.W związku z tym mieszaninę reakcyjną można przygotować, łącząc odczynniki pojedynczo lub można przygotować mieszaninę główną zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem matrycowego RNA.W zależności od struktury matrycy RNA, oddzielne etapy denaturacji RNA i hybrydyzacji starterów mogą poprawić wyniki RT-PCR.
Protokol
I.Synteza pierwszej nici cDNA
1. Dodać następujące odczynniki do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki umieszczonej na lodzie we wskazanej kolejności:
Matrycowy RNA |
mRNA poli(A). lub specyficznego RNA |
1-5 μg |
Elementarz |
oligo (dT)15Elementarz lub losowy podkład heksamerowy |
1 ul 1 ul |
Woda oczyszczona DEPC | do 12,4 μl | |
Maksymalna głośność | 12,4 μl |
2. Delikatnie wymieszać, krótko odwirować i inkubować w temperaturze 70°C przez 5 min.Schłodzić na lodzie, odwirować i umieścić fiolkę z powrotem na lodzie.
3. Przygotuj następującą mieszankę do syntezy cDNA, dodaj następujące składniki we wskazanej kolejności:
5 × bufor pierwszej nici | 4 μl |
dNTP (każdy po 10 mM) | 1 ul |
RNasin | 0,6 μl |
M-MLV | 1 ul |
4. Delikatnie wymieszać i krótko odwirować.
5. Dla oligo(dT)15inkubować przez 60 min w 42°C.W przypadku losowej syntezy zapoczątkowanej heksamerem, inkubować przez 60 min w 37°C.
6. Zakończ reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70°C przez 5 min.
Produkt reakcji odwrotnej transkrypcji można zastosować natychmiast w reakcjach syntezy drugiej nici cDNA lub przechowywać w -20°C przez mniej niż tydzień.W przypadku dłuższego przechowywania zaleca się -70°C.
II.Amplifikacja PCR pierwszej nici cDNA
Produkt syntezy pierwszej nici cDNA może być użyty bezpośrednio w PCR lub qPCR.Objętość mieszaniny reakcyjnej do syntezy pierwszej nici cDNA nie powinna stanowić więcej niż 1/10 całkowitej objętości reakcji PCR.Zwykle 2 μl mieszaniny reakcyjnej syntezy pierwszej nici cDNA stosuje się jako matrycę do późniejszego PCR w całkowitej objętości 50 μl.
Dongsheng Biotech oferuje różne serie produktów, które pomogą Ci osiągnąć sukces PCR.W przypadku enzymów nasza polimeraza Taq, polimeraza DNA HS Taq, polimeraza DNA Taq FS, polimeraza DNA Pfu i polimeraza DNA Fusion Pfu zapewniają wysoką wierność, wydajność i czułość reakcji PCR.Posiadamy również polimerazę DNA Long Taq zapewniającą długą wydajność reakcji PCR.