• Zestaw do syntezy pierwszej nici CDNA R1011/R1012 Odczynniki PCR z odwrotną transkryptazą
Zestaw do syntezy pierwszej nici CDNA R1011/R1012 Odczynniki PCR z odwrotną transkryptazą

Zestaw do syntezy pierwszej nici CDNA R1011/R1012 Odczynniki PCR z odwrotną transkryptazą

Szczegóły Produktu:

Miejsce pochodzenia: Chiny
Nazwa handlowa: GDSBio
Orzecznictwo: /
Numer modelu: R1011/R1012

Zapłata:

Minimalne zamówienie: 1 pudełko
Szczegóły pakowania: mała paczka lub dystrybucja hurtowa lub OEM
Czas dostawy: 8 dni roboczych
Zasady płatności: L/C, D/A, D/P, T/T, Western Union, MoneyGram
Możliwość Supply: 100 pudełek / pudełek dziennie
Najlepsza cena Kontakt

Szczegóły informacji

Kot. NIE.: R1011/R1012 Stężenie: R1011 (20 rxns), R1012 (100 rxns)
Wygląd: bezbarwny Grupa: Odczynniki do PCR z odwrotną transkryptazą
Działalność: Przechodzić Możliwość wzmocnienia: /
Drukowanie logo: Z nadrukiem logo Pakiet transportowy: Uszczelka
Zdolność produkcyjna: 100 pudełek / pudełek dziennie Warunki przechowywania: Przechowywać w temperaturze -20°C
High Light:

20 rxns odczynników do PCR z odwrotną transkryptazą

,

100 odczynników do PCR z odwrotną transkryptazą rxns

,

20 rxns zestaw do syntezy pierwszej nici cdna

opis produktu

Zestaw RT - PCR

Wyłącznie do użytku badawczego

Nr kat. R1011, 20 rxns

Nr kat. R1012, 100 rxns

 

Elementy zestawu

Część R1011 (20 rxns) R1012 (100 rxns)
M-MLV (200U/μl) 20 μl 100 μl
RNazyna (40 U/μl) 12 μl 60 μl
oligo(dT)15(50μM) 20 μl 100 μl
Losowy podkład heksamerowy (50 μM) 20 μl 100 μl
5× Bufor pierwszej nici 80 μl 400 μl
ddH wolne od RNaz2O 1 ml 1 ml × 5
dNTP (po 10 mM) 50 μl 250 μl

 

Składowanie

Wszystkie elementy zestawu należy przechowywać w temperaturze -20°C.Przechowywać kontrolne RNA w temperaturze -70°C w celu dłuższego przechowywania.

 

Dopis

Zestaw RT-PCR jest zoptymalizowany do syntezy pierwszej nici cDNA z oczyszczonego poli(A)+ lub całkowitego RNA.Zestaw RT-PCR do RT-PCR zapewnia zwiększoną wydajność cDNA, wysoką czułość i transkrypty pełnej długości w wygodnym formacie.Otrzymujesz wszystkie składniki potrzebne do udanej syntezy pierwszej nici cDNA, oszczędzając czas i zapewniając sukces w każdym eksperymencie.Zestaw Reverse Transcriptase to wersja M-MLV RT, która została zaprojektowana w celu zmniejszenia aktywności RNazy H i zapewnienia zwiększonej stabilności termicznej.Enzym jest używany do syntezy cDNA w zakresie temperatur 42-55°C, zapewniając zwiększoną specyficzność, wyższą wydajność cDNA i produkt o większej długości niż inne odwrotne transkryptazy.

 

Aplikacje

Synteza pierwszej nici cDNA do RT-PCR

Konstrukcja bibliotek cDNA

Jednoetapowy RT-PCR

Przedłużenie podkładu

 

Iważne notatki

Unikanie zanieczyszczenia rybonukleazą

Czystość i integralność RNA jest niezbędna do syntezy pełnej długości cDNA.RNA może zostać zdegradowane przez RNazę A, która jest wysoce stabilnym zanieczyszczeniem występującym w każdym środowisku laboratoryjnym.Wszystkie elementy zestawu zostały rygorystycznie przetestowane, aby upewnić się, że są wolne od RNaz.Aby zapobiec zanieczyszczeniu zarówno środowiska laboratoryjnego, jak i odczynników, wszystkie przygotowane roztwory muszą być wolne od RNaz.Ogólne zalecenia dotyczące unikania kontaminacji RNazami:

  • Wszystkie probówki i końcówki pipet, które mają być użyte w syntezie cDNA, należy poddać obróbce DEPC lub używać certyfikowanego sprzętu laboratoryjnego wolnego od nukleaz.
  • Podczas pracy z RNA i wszystkimi odczynnikami należy nosić rękawiczki, ponieważ skóra jest częstym źródłem RNaz.Często zmieniaj rękawiczki.
  • Należy używać odczynników wolnych od RNaz, w tym wody wysokiej jakości (np. wody oczyszczonej DEPC).
  • Użyj inhibitora RNazy, takiego jak Dongsheng RNasin (#R2011), aby chronić RNA przed działaniem RNaz.
  • Wszystkie elementy zestawu należy szczelnie zamknąć, gdy nie są używane.Trzymaj wszystkie probówki szczelnie zamknięte podczas reakcji odwrotnej transkrypcji.

 

Matrycowy RNA

Całkowity komórkowy RNA wyizolowany standardowymi metodami jest odpowiedni do użycia z zestawem.Oczyszczone RNA musi być wolne od soli, jonów metali, etanolu i fenolu, aby uniknąć hamowania reakcji syntezy cDNA.Zanieczyszczenia śladowe można usunąć przez wytrącenie RNA etanolem, a następnie dwukrotne przemycie osadu zimnym 75% etanolem.W zastosowaniach RT-PCR matryca RNA musi być wolna od zanieczyszczenia DNA.Przed syntezą cDNA RNA można potraktować DNazą I w celu usunięcia śladowych ilości DNA.DNaza I musi być uzyskana przez użytkownika.Zawsze przeprowadzaj reakcję kontrolną (RT-minus), która obejmuje wszystkie składniki RT-PCR z wyjątkiem enzymu odwrotnej transkryptazy.

 

Trawienie RNazą H

Czułość etapu PCR można zwiększyć (zwłaszcza w przypadku długich matryc) poprzez usunięcie matrycy RNA z hybrydowej cząsteczki cDNA:RNA przez trawienie RNazą H po syntezie pierwszej nici.Obecność RNazy H podczas syntezy pierwszej nici spowoduje degradację matrycowego mRNA, co spowoduje zmniejszenie syntezy pełnej długości cDNA i zmniejszoną wydajność pierwszej nici cDNA.

 

Podkłady

Syntezę pierwszej nici cDNA można zapoczątkować starterem oligo(dT)15, starterami losowymi lub starterami specyficznymi dla genu.

Oligo(dT)15 inicjuje syntezę cDNA z ogona poli(A) obecnego na 3'-końcu eukariotycznego mRNA.Losowe startery inicjują syntezę cDNA z całkowitej populacji RNA (rRNA i mRNA).Dlatego stosowanie losowych starterów do syntezy pierwszej nici powoduje większą złożoność generowanego cDNA w porównaniu ze starterem oligo(dT)15.W konsekwencji czułość i specyficzność kolejnych reakcji PCR może być zmniejszona.Istnieje jednak kilka zastosowań, w których korzystne jest użycie losowych starterów, takich jak synteza cDNA przy użyciu mRNA bez ogona poli(A) lub synteza cDNA przy użyciu próbek RNA wzbogaconych w poli(A).

Startery specyficzne dla genu są używane do syntezy określonego cDNA z puli całkowitego RNA lub mRNA i muszą być uzyskane przez użytkownika.

 

Pierwszy- Sprocedura syntezy cDNA trand

Reakcja pierwszej nici cDNA może być przeprowadzona jako pojedyncza reakcja lub jako seria równoległych reakcji z różnymi matrycami RNA.W związku z tym mieszaninę reakcyjną można przygotować, łącząc odczynniki pojedynczo lub można przygotować mieszaninę główną zawierającą wszystkie składniki z wyjątkiem matrycowego RNA.W zależności od struktury matrycy RNA, oddzielne etapy denaturacji RNA i hybrydyzacji starterów mogą poprawić wyniki RT-PCR.

Protokol

I.Synteza pierwszej nici cDNA

1. Dodać następujące odczynniki do sterylnej, wolnej od nukleaz probówki umieszczonej na lodzie we wskazanej kolejności:

Matrycowy RNA

mRNA poli(A).

lub specyficznego RNA

1-5 μg
Elementarz

oligo (dT)15Elementarz

lub losowy podkład heksamerowy

1 ul

1 ul

Woda oczyszczona DEPC do 12,4 μl
Maksymalna głośność 12,4 μl

2. Delikatnie wymieszać, krótko odwirować i inkubować w temperaturze 70°C przez 5 min.Schłodzić na lodzie, odwirować i umieścić fiolkę z powrotem na lodzie.

3. Przygotuj następującą mieszankę do syntezy cDNA, dodaj następujące składniki we wskazanej kolejności:

5 × bufor pierwszej nici 4 μl
dNTP (każdy po 10 mM) 1 ul
RNasin 0,6 μl
M-MLV 1 ul

4. Delikatnie wymieszać i krótko odwirować.

5. Dla oligo(dT)15inkubować przez 60 min w 42°C.W przypadku losowej syntezy zapoczątkowanej heksamerem, inkubować przez 60 min w 37°C.

6. Zakończ reakcję przez ogrzewanie w temperaturze 70°C przez 5 min.

Produkt reakcji odwrotnej transkrypcji można zastosować natychmiast w reakcjach syntezy drugiej nici cDNA lub przechowywać w -20°C przez mniej niż tydzień.W przypadku dłuższego przechowywania zaleca się -70°C.

 

II.Amplifikacja PCR pierwszej nici cDNA

Produkt syntezy pierwszej nici cDNA może być użyty bezpośrednio w PCR lub qPCR.Objętość mieszaniny reakcyjnej do syntezy pierwszej nici cDNA nie powinna stanowić więcej niż 1/10 całkowitej objętości reakcji PCR.Zwykle 2 μl mieszaniny reakcyjnej syntezy pierwszej nici cDNA stosuje się jako matrycę do późniejszego PCR w całkowitej objętości 50 μl.

 

M-Mlv Reverse Transcriptase Rt-PCR

M-Mlv Reverse Transcriptase Rt-PCR
Dongsheng Biotech oferuje różne serie produktów, które pomogą Ci osiągnąć sukces PCR.W przypadku enzymów nasza polimeraza Taq, polimeraza DNA HS Taq, polimeraza DNA Taq FS, polimeraza DNA Pfu i polimeraza DNA Fusion Pfu zapewniają wysoką wierność, wydajność i czułość reakcji PCR.Posiadamy również polimerazę DNA Long Taq zapewniającą długą wydajność reakcji PCR.

M-Mlv Reverse Transcriptase Rt-PCR

Chcesz dowiedzieć się więcej o tym produkcie
Jestem zainteresowany Zestaw do syntezy pierwszej nici CDNA R1011/R1012 Odczynniki PCR z odwrotną transkryptazą czy mógłbyś przesłać mi więcej informacji, takich jak rodzaj, rozmiar, ilość, materiał itp.
Dzięki!
Czekam na Twoją odpowiedź.