GDSBio NGS Budowa biblioteki Szybka biblioteka DNA Plus zestaw przygotowawczy dla MGI

opis produktu

Szybka biblioteka DNAPlusZestaw przygotowawczydla MGI

[Nazwa produktu]

Zestaw przygotowawczy Fast DNA Library Plus dla MGI

[Kot.Nr/Spec.]

KM004-A/24 rxns;KM004-B/96 rxns;worek na próbki / 6 rxns

[Opis produktu]

Mając na celu wysokowydajną platformę sekwencjonowania MGI, zestaw ten zapewnia wygodny i uniwersalny schemat konstrukcji biblioteki DNA w jednej probówce.Łączy fragmentację, naprawę końcówek i A-Tailing w jednym kroku, znacznie skracając czas budowy biblioteki i redukując błąd powodowany przez żmudne kroki.Po fragmentacji i przygotowaniu końców, produkt można bezpośrednio zligować z adapterem bez dodatkowego oczyszczania, a dalsza procedura jest taka sama jak w przypadku zestawu #KM001 Fast DNA Library Prep Kit for MGI.Pełne oznaczenie ilościowe biblioteki można przeprowadzić metodą barwnika fluorescencyjnego dsDNA (np. Thermo Qubit Flex Fluorometer) lub bezwzględną ilościową metodą PCR po rozcieńczeniu biblioteki do odpowiedniego stężenia.

[Typ próbki]

Tabela 1 Zalecane dane wejściowe dla wspólnego DNA

[Warunki przechowywania i trwałość]

Wszystkie odczynniki należy przechowywać w temperaturze -20°C.Wytrącanie się kryształów w buforze ligacyjnym jest zjawiskiem normalnym w niskich temperaturach, dlatego przed użyciem należy doprowadzić go do temperatury pokojowej.Produkt jest ważny przez 12 miesięcy.

[Składniki]

*FEP Buffer to bufor do fragmentacji i przygotowania końcówek.FEP Enzyme Mix to mieszanka enzymów związanych z fragmentacją i przygotowaniem końcowym.

* Jeśli jest więcej niż jedna próbka, zalecana jest mieszanka primerów adaptera #KM002 i #KM003.Ten zestaw zawiera zestaw starterów, sekwencja starterów jest następująca:

5'-TGTGAGCCAAGGAGTTG-3'

5'-GAACGACATGGCTACGA-3'

Uwaga: zalecane koraliki selekcyjne: #NC1011 GDSPure DNA Selection Magbeads lub koraliki AMPure XP.

[Notatki]

1. Oferujemy dwa rodzaje zestawów starterów Universal Adapter (Adapter GDS, #KM002 i #KM003, do kupienia osobno), ale klienci mogą również wybierać spośród innych producentów lub zsyntetyzować własny Adapter do platformy sekwencjonowania MGI.Zbyt duży adapter doprowadzi do powstania dimeru adaptera, a niewystarczający adapter doprowadzi do niskiej wydajności biblioteki.Dlatego odpowiednie stężenie adaptera decyduje o stężeniu i jakości biblioteki.Zalecane stężenia adapterów dla różnych ilości wejściowego DNA przedstawiono w poniższej tabeli:

Tabela 2 Zalecane stężenia użytkowe adaptera

* Wyrażony jako stosunek objętości adaptera do rozcieńczalnika

2. Enzym zastosowany w 2× HIFI Library PCR Master Mix to polimeraza DNA z rodziny B, która ma aktywność polimerazy 5 „-3” i aktywność egzonukleazy 3 „-5”, ale brakuje jej aktywności egzonukleazy 5 „-3”.Ma wysoką wierność i jednorodność oraz silną zdolność zrównoważonej syntezy.Ścisła kontrola liczby cykli amplifikacji jest szczególnie ważna dla wydajności biblioteki.Poniższa tabela przedstawia zalecaną liczbę cykli amplifikacji odpowiadającą różnym ilościom wejściowego DNA:

Tabela 3 Zalecana liczba cykli amplifikacji odpowiadająca różnym wejściowym próbkom

Uwaga: 1. Powyższa tabela przedstawia wyniki testu przy użyciu standardowego DNA o wielkości 150 bp, który służy wyłącznie jako odniesienie.

2. W przypadku użycia niekompletnych łączników należy przeprowadzić amplifikację w minimalnej liczbie cykli (1-3), aby uzyskać kompletną bibliotekę.

3. Jeżeli jakość wejściowego DNA jest słaba lub podczas konstruowania biblioteki przeprowadzana jest selekcja wielkości, należy odpowiednio zwiększyć liczbę cykli amplifikacji.

[Proces budowy biblioteki standardowej]

Fragmentacja i naprawa końcówek

1. Określ skład rozpuszczalnika matrycy DNA, jeśli nie ma EDTA, przejdź bezpośrednio do kroku 2;Jeśli zawiera EDTA, do oczyszczenia należy użyć kulek magnetycznych 2,2x lub dodać odpowiednią objętość buforu neutralizującego zgodnie z zawartością EDTA w poniższej tabeli dotyczącej neutralizacji:

2. Przygotuj następującą reakcję w 200 μl probówce do PCR:

3. Dodaj 10 μl FEP Enzyme Mix do powyższego systemu, równomiernie przedmuchaj, krótko odwiruj inatychmiast umieścić w aparacie PCR do następnej reakcji:

Tabela 4 Czas przechowywania wymagany do uzyskania bibliotek o różnej wielkości

Adapter Łigacja

1. Kontynuuj reakcję ligacji tak szybko, jak to możliwe po rozdrobnieniu i przygotowaniu końcówek.

2. Rozcieńczyć adapter zgodnie z tabelą 2.

3. Przygotuj następujący układ reakcyjny:

4. Delikatnie worteksować i krótko odwirować, aby dobrze wymieszać, krótko odwirować i zebrać cały płyn na dno probówki.

5. Wykonaj następującą reakcję w termocyklerze:

ZalecanaSrozwiązanie dlaOczyszczanie PCR/Wybór rozmiaru(konkretna objętość kulki magnetycznej powinna być dostosowana zgodnie z rzeczywistą próbkąrozmiar)

1. Przygotuj 100 μl produktów ligacji do odpowiedniej probówki wirówkowej.

2. Dodać do próbki 100 μl ponownie zawieszonych kulek magnetycznych do selekcji DNA.Delikatnie dmuchać pipetą 10 razy (lub worteksować przez 30 s).Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

3. Umieść probówkę na odpowiednim stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu.Gdy roztwór stanie się klarowny, ostrożnie usuń i odrzuć supernatant za pomocą pipety (nie wyrzucaj kulek).

4. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki znajdującej się na statywie magnetycznym.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i odrzucić supernatant (nie naruszać perełek).

5. Powtórz Krok 4 jeden raz, łącznie dla dwóch prań.

Uwaga: Pamiętaj, aby usunąć cały widoczny płyn po drugim praniu.

6. Suszyć kulki na powietrzu, aż powierzchnia kulek magnetycznych nie będzie miała wyraźnego połysku, gdy probówka znajduje się na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.

Uwaga: Nie przesuszaj perełek, może to skutkować niższym odzyskiem DNA.Kiedy koraliki zaczną pękać, oznacza to, że są zbyt suche.

7. Wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego.Dodać do probówki 22 μl buforu do elucji (10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5).Dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół co najmniej 10 razy lub na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund.Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej.

8. Umieść probówkę na statywie magnetycznym.Po 5 minutach (lub gdy roztwór jest klarowny) przenieść 20 μl supernatantu do nowej probówki.Selekcja jest zakończona, a wyselekcjonowane DNA można wykorzystać do kolejnych eksperymentów lub przechowywać przez długi czas w temperaturze -20°C.

Wzmocnienie biblioteki

1. Przygotuj następującą reakcję w probówce do PCR:

2. Delikatnie worteksować i krótko odwirować, aby dobrze wymieszać, krótko odwirować i zebrać cały płyn na dno probówki.

3. Wykonaj następującą reakcję w termocyklerze:

ZalecanaSrozwiązanie dlaOczyszczanie PCR/Wybór rozmiaru(konkretna objętość kulki magnetycznej powinna być dostosowana zgodnie z rzeczywistą próbkąrozmiar)

1. Przygotuj 50 μl produktów ligacji do odpowiedniej probówki wirówkowej.

2. Dodać do próbki 45 μl ponownie zawieszonych kulek magnetycznych do selekcji DNA.Delikatnie dmuchać pipetą 10 razy (lub worteksować przez 30 s).Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

3. Umieść probówkę na odpowiednim stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu.Gdy roztwór stanie się klarowny, ostrożnie usuń i odrzuć supernatant za pomocą pipety (nie wyrzucaj kulek).

4. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki znajdującej się na statywie magnetycznym.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i odrzucić supernatant (nie naruszać perełek).

5. Powtórz Krok 4 jeden raz, łącznie dla dwóch prań.

Uwaga: Pamiętaj, aby usunąć cały widoczny płyn po drugim praniu.

6. Suszyć kulki na powietrzu, aż powierzchnia kulek magnetycznych nie będzie miała wyraźnego połysku, gdy probówka znajduje się na stojaku magnetycznym z otwartą pokrywą.

Uwaga: Nie przesuszaj perełek, może to skutkować niższym odzyskiem DNA.Kiedy koraliki zaczną pękać, oznacza to, że są zbyt suche.

7. Wyjmij probówkę ze statywu magnetycznego.Dodać do probówki 22 μl buforu do elucji (10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5).Dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół co najmniej 10 razy lub na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund.Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej.

8. Umieść probówkę na statywie magnetycznym.Po 5 minutach (lub gdy roztwór jest klarowny) przenieść 20 μl supernatantu do nowej probówki.Selekcja jest zakończona, a wybrane DNA można przechowywać w temperaturze 2-8°C przez 1-2 tygodnie lub przechowywać w temperaturze -20°C przez długi czas.

[Dodatek]Zalecany schemat wyboru dwustronnego

Jeśli wymagana jest selekcja podwójna, zapewniamy następujący schemat wyboru odpowiedniej objętości kulek magnetycznych zgodnie z oczekiwaną wielkością biblioteki.Wyboru rozmiaru można dokonać przed naprawą końców lub po amplifikacji.Dwie lub więcej podwójnych rund selekcji znacznie zmniejszy wydajność biblioteki.

Wypełnij objętość biblioteki w poniższej tabeli do 100 μl.Wybierz objętość kulek magnetycznych w dwóch rundach zgodnie z oczekiwaną wielkością biblioteki.I przeprowadź operację wyboru zgodnie z poniższymi instrukcjami.

Tabela 5 Zalecana ilość koralików magnetycznych do podwójnej selekcji

1. Wypełnij objętość biblioteki do 100 μl w 200 μl probówce do PCR i oznacz jako A. Dodaj pewną objętość kulek magnetycznych zgodnie z Tabelą 5 (Runda 1) do probówki A. Delikatnie dmuchaj pipetą przez 30 s.Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

2. Umieść probówkę A na odpowiednim stojaku magnetycznym, aby oddzielić kulki od supernatantu.Gdy roztwór stanie się klarowny, ostrożnie przenieś supernatant do nowej probówki i oznacz ją jako B. Odrzuć kulki.

3. Dodać określoną ilość kulek magnetycznych zgodnie z Tabelą 5 (Runda 2) do probówki B. Delikatnie dmuchać pipetą przez 30 sekund.Inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze pokojowej.Umieść probówkę B na statywie magnetycznym.Gdy roztwór stanie się klarowny, ostrożnie usuń i odrzuć supernatant.

4. Dodaj 200 μl świeżo przygotowanego 80% etanolu do probówki B znajdującej się na statywie magnetycznym.Inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 s, a następnie ostrożnie usunąć i odrzucić supernatant (nie naruszać perełek).

5. Powtórz Krok 6 jeden raz, łącznie dla dwóch prań.

Uwaga: Pamiętaj, aby usunąć cały widoczny płyn po drugim praniu.

6. Suszyć kulki na powietrzu, aż powierzchnia kulek magnetycznych nie będzie miała wyraźnego połysku, podczas gdy probówka B znajduje się na statywie magnetycznym z otwartą pokrywą.

Uwaga: Nie przesuszaj perełek, może to skutkować niższym odzyskiem DNA.Kiedy koraliki zaczną pękać, oznacza to, że są zbyt suche.

7. Wyjmij probówkę B ze statywu magnetycznego.Dodać do probówki 22 μl buforu do elucji.Dobrze wymieszać, pipetując w górę iw dół co najmniej 10 razy lub na mieszadle wibracyjnym przez 30 sekund.Inkubować przez 3-5 minut w temperaturze pokojowej.

Uwaga: Jeśli docelowe wychwytywanie nie zostanie przeprowadzone, dodać bufor do elucji (10 mM Tris-HCl, pH 8,0-8,5) w celu elucji.W przeciwnym razie do elucji należy użyć sterylizowanej ultraczystej wody.

• Umieść probówkę B na statywie magnetycznym.Przenieść 20 μl supernatantu do nowej probówki.

Wyłącznie do użytku badawczego

GDSBio to zaawansowane technologicznie przedsiębiorstwo zajmujące się badaniami i rozwojem, produkcją i sprzedażą wysokiej jakości produktów z zakresu nauk przyrodniczych.Firma posiada kompletną linię produktów, z technologią PCR jako rdzeniem, koncentrując się na ogólnym PCR, fluorescencyjnym ilościowym PCR, przechowywaniu NGS, elektroforezie kwasów nukleinowych i innych technologiach biologii molekularnej, a także opracowała odczynniki do badań molekularnych, surowce do diagnostyki molekularnej in vitro, odczynniki do ekstrakcji i wykrywania kwasów nukleinowych oraz inne produkty.